Luppi A., Perillo A.
Istituto di Anatomia Patologica - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Parma
Per pesticida secondo il gruppo di lavoro della Federal Environment Pesticide Control dell’O.M.S., si intende "una sostanza o una miscela di sostanze atte a prevenire, distruggere, allontanare o attenuare qualsiasi avversità (insetto, nematode, fungo, erbe nocive ed altre forme di piante terrestri ed acquatiche, sia di vita animale o di virus, batteri o altri microrganismi al di fuori di quelli che colpiscono l’uomo o gli altri animali viventi) e qualsiasi sostanza o miscela di sostanze usate come influenzanti la vita delle piante, compresi i defoglianti e gli essicanti".
In Italia al termine di pesticida di origine anglosassone viene preferito quello di fitofarmaco o, sebbene più limitativo, quello di antiparassitario.
La grande varietà di fitofarmaci (fertilizzanti fogliari, fisiofarmaci, fitoregolatori, diserbanti, fungicidi, insetticidi, acaricidi, nematodicidi, limacidi, ecc.) e la continua modificazione strutturale dei principi attivi per aumentarne l’efficacia spiega l’enorme diffusione raggiunta nella lotta contro gli insetti, dove senza alcun dubbio sono stati ottenuti i successi più numerosi e costanti. Tuttavia accanto alla loro indiscussa utilità questi composti prospettano un grave inconveniente: l’elevatissima tossicità per gli animali e per l’uomo.
La loro immissione nell’ambiente rappresenta, quindi, una continua fonte di rischio, polimorfa, quantitativamente ingente, che espone al pericolo di intossicazioni acute o croniche, anche gravi l’uomo e molte specie animali, non solo quelle confinabili al mondo agricolo-rurale, ma investendo pure gli animali dell’ambiente urbano, dove i casi di intossicazione da insetticidi non sono del tutto infrequenti da registrare.
Lo studio delle intossicazioni da pesticidi, dolose od accidentali, negli animali d’affezione ed in particolare nel cane costituisce pertanto un capitolo della patologia veterinaria importante, complesso e sempre attuale.
Il rischio tossicologico per il cane, se non di natura dolosa mirata è per lo più legato, alla somministrazione accidentale del fitofarmaco nell’acqua di bevanda o nell’alimento, oppure dovuto ad un’esposizione occasionale, allorchè l’animale sosta o transita su un terreno (per lo più frutteto) irrorato direttamente dall’insetticida; oppure indirettamente, per effetto della ventilazione, che sposta il tossico su un altro terreno, introduce, inala o assorbe il principio attivo irrorato. Altra possibilità non infrequente d’intossicazione deriva dall’utilizzo di recipienti, che hanno contenuto e nel quale è residuata parte del pesticida, per l’abbeverata od il pasto dell’animale stesso.
In un simile rischio connesso all’uso di pesticidi si inserisce la presente nota, intesa a descrivere due episodi d‘intossicazione acuta da noi osservati a distanza di circa un mese l’uno dall’altro, su due cani boxer, madre e figlia, appartenenti allo stesso proprietario e che vivevano in un ambiente rurale, intossicati da methomyl (S-metil N-metilcarbamoil-ossi tioacetimidato) meglio conosciuto con il nome di Lannate (Lannate, 25, Terlate), un carbammato eterociclico, appartenente alla V° classe dei presidi sanitari, usato prevalentemente come insetticida.
La tossicità acuta di formulati commerciali contenenti carbammati eterociclici come principio attivo è ormai sufficientemente conosciuta (Delaunois et al 1997) e viene per lo più correlata alla sintomatologia clinica, alle valutazioni ematochimiche, ad indagini anamnestiche, a determinazioni chimiche, alla ricerca biologica nonché al quadro necroscopico.
Il Lannate, appartiene ad una grande famiglia di pesticidi a larghissima diffusione, i carbammati eterociclici, e grazie ad alcune sue caratteristiche (tossicità meno grave e di durata più breve nei confronti dei mammiferi, ridotta permanenza nell’ambiente e formazione di metaboliti scarsamente dannosi) sta rimpiazzando gradualmente altri prodotti ad azione analoga come gli organofosfati.
Pure i quest’ambito il methomyl tra i carbammati è uno dei più tossici, la sua DL50 per via orale nel ratto è pari a 17 mg/Kg di P.V., quando il propoxur (Baygon) od il Carbaryl hanno rispettivamente una DL50 di 83-104 e 250-721 mg/Kg di P.V. (1).
Il methomyl risulta essere ugualmente tossico per inalazione, per contatto con le mucose, buccale, nasale, congiuntivale e con la cute (DL50 pari a 1000 mg/kg se la cute presenta delle escoriazioni).
Dopo ingestione viene rapidamente assorbito nel tratto digestivo e la sua emivita, come per gli altri carbammati, è piuttosto ridotta. Nelle 24 ore successive all’assunzione, l’80-90% della dose ingerita è eliminata attraverso le urine (1).
Il processo di assorbimento attraverso l’apparato digerente può essere più o meno rapido a causa della possibile formazione di composti insolubili o di degradazione, l’insorgenza e la intensità di vomito e diarrea ed in relazione all’integrità funzionale del fegato, organo principalmente interessato alla sua metabolizzazione.
Anche l’inalazione di vapori, di goccioline fini o di polveri può rivestire particolare importanza nella comparsa dell’intossicazione, in ragione della vasta superficie di assorbimento rappresentata dal letto alveolare e per la possibilità che ha il tossico di raggiungere rapidamente le strutture nervose senza l’intervento di quei processi metabolici di protezione che entrano in funzione quando l’assorbimento avviene tramite l’apparato digerente. L’intossicazione da carbammati può avvenire anche per contatto attraverso la cute, specie se lesa; per questa via assorbimenti protratti di microdosi di carbammati possono provocare per il loro tropismo anche quadri di reattività cutanea allergica (Rosenstein and Brice 1975).
L’azione tossica del methomyl consiste in una inibizione dell’enzima acetilcolinesterasi responsabile della degradazione dell’acetilcolina, il neuromediatore del sistema nervoso parasimpatico. L’acetilcolina, non più distrutta, si accumula a livello delle sinapsi nervose, provocando una stimolazione esagerata dei recettori colinergici (2).
La maggior labilità del legame enzima-carbammato, contrariamente a quello che si osserva per gli organofosforici, è reversibile, ed esita nella liberazione spontanea di una certa quantità di acetilcolinesterasi attiva. La determinazione dell’attività dell’acetilcolinesterasi ematica, per questo motivo, non è altrettanto valida come nel caso di intossicazione da organofosforici (3).
Da un punto di vista funzionale, quindi, il blocco della normale attività colinesterasica esercitato dai carbammati si traduce in un’anomala inibizione dei processi fisiologici di idrolisi enzimatica dell’acetilcolina che, non venendo distrutta nel tempo utile fisiologico, continua ad esercitare la mediazione chimica nervosa, creando uno stato di abnorme iperfunzionalità del sistema nervoso colinergico. Si instaura così, a livello di molteplici distretti organici, una grave e complessa fenomenologia morbosa, non raramente mortale, che riconosce appunto, come principale momento patogenetico, l’alterata funzionalità della regolazione nervosa vegetativa e motorio-somatica.
L’accumulo di acetilcolina nei siti colinorecettivi colinergici provoca quindi una rapida iperstimolazione parasimpatica che si manifesta con effetti di tipo muscarinico, nicotinico e centrale.
I segni clinici che si osservano in caso di intossicazione acuta possono essere di tre tipi:
I primi sintomi che vengono normalmente rilevati corrispondono alla stimolazione dei recettori muscarinici dell’acetilcolina: scialorrea, scolo nasale sieroso, debolezza muscolare, miosi, sudorazione, aumento del tono e della peristalsi del tubo gastro-enterico, che si manifesta con dolorabilità addominale, vomito, diarrea, tenesmo, defecazione e minzione involontarie. A livello respiratorio, il broncospasmo e l’aumento della secrezione bronchiale sono note, così come l’edema polmonare che in certi casi può condurre a morte (collasso cardio-respiratorio). In questa prima fase osserviamo inoltre un effetto bradicardizzante (2, 4).
Alla prima fase segue una sindrome nicotinica, per stimolazione degli omonimi recettori, con comparsa di crampi, convulsioni, fascicolazioni muscolari. Ipertermia, tachicardia e midriasi sono fenomeni facilmente osservabili in questa seconda fase. La morte sopravviene normalmente per paralisi dei muscoli respiratori (2,3).
Nel terzo ed ultimo stadio compaiono sintomi come fobia, letargia, abbattimento del sensorio, ipotensione che può sfociare in una condizione comatosa dell’animale (4).
L’avvelenamento cronico, più supposto che reale, si manifesterebbe generalmente in quegli animali che hanno superato la fase acuta (2).
E’ fuori dubbio che di fronte alla morte improvvisa di un animale la diagnosi di sospetto avvelenamento, doloso od accidentale, può essere formulata se si tiene presente che l’evento risulta possibile. Va da sé che in corso di intossicazione acuta da methomyl, prevalentemente caratterizzata da effetti tossici funzionali, da diversi riscontri clinici e scarsi reperti anatomopatologici, al perito settore non è facile formulare una corretta diagnosi, se non ha il prezioso conforto delle informazioni anamnestiche, sull’ambiente in cui vive l’animale, sul sospetto di una possibile esposizione al tossico, nonché il supporto dell’esame chimico di identificazione del fitofarmaco. In un simile contesto l’accertamento necroscopico sembrerebbe perdere di valenza diagnostica, mentre nella realtà dei fatti assume importanza fondamentale nell’indirizzare ed integrare le ricerche (chimiche ed eventualmente biologiche) per una diagnosi di certezza.
Va precisato che l’identificazione di un pesticida non sempre ha valore conclusivo, se non è dimostrato che quantitativamente la concentrazione rinvenuta può risultare mortale per lo stesso animale.
Infatti solo una corretta collaborazione tra proprietario, clinico ed anatomopatologo può fornire i dati necessari al lavoro del tossicologo. L’esame tossicologico infatti deve essere mirato all’individuazione di non più di una o due molecole, dal momento che risulta pressochè impossibile determinare gli oltre 300 principi attivi ad azione fitofarmacologica registrati presso il nostro Ministero della Sanità, nonché i relativi 5000 formulati commerciali, tenendo ben presente l’oneroso costo delle indagini ed il tempo necessario per portarle a termine.
Avendo avuto occasione di osservare due casi di intossicazione acuta da methomyl in due cani boxer, abbiamo ritenuto opportuno riportare i rilievi fatti a scopo peritale, anche perché in letteratura i casi mortali accidentali correlati direttamente a tale insetticida sono del tutto infrequenti.
Presso il nostro Istituto sono stati portati 2 cani di razza boxer di sesso femminile, con età di 3 ed 1 anno (rispettivamente madre e figlia), deceduti a distanza di un mese l’una dall’altra.
Il proprietario aveva richiesto che sui due animali venisse eseguito un esame autoptico, avanzando l’ipotesi che i cani fossero stati oggetto di avvelenamento dal momento che circa 40 giorni prima gli era morto improvvisamente anche un altro soggetto di 6 mesi necroscopicamente refertato dal veterinario curante come quadro di cardiomiopatia dilatativa idiopatica pur avendo presentato anamnesticamente andatura vacillante, decubito apatico, disturbi respiratori, inappetenza e scialorrea.
Dei due soggetti venuti alla nostra attenzione la madre era stata trovata morta dal proprietario nella campagna circostante la propria abitazione, senza che questi potesse osservare alcun sintomo intravitam nell’animale. La figlia, invece aveva manifestato, poco prima del decesso, una sintomatologia caratterizzata da tremori muscolari, dispnea, rigidità degli arti, scialorrea, inappetenza, miosi, pollachiuria e lacrimazione.
Tutti gli animali erano tenuti liberi in un ampio terreno recintato, confinante con un frutteto e sorvegliavano un piccolo allevamento di tacchini.
I due animali si presentavano in buone condizioni generali di nutrizione ed all’esame autoptico si metteva in evidenza il tatuaggio identificativo nel piatto interno della coscia destra senza rinvenire alcunchè di anomalo all’esame esterno della cute.
Estese macchie ipostatiche di color rosso vinoso si presentavano nelle regioni declivi.
Sparse infiltrazioni emorragiche si evidenziavano a carico del sottocute nelle regioni toraciche ed addominali. Le mucose apparenti risultavano fortemente congeste.
Nulla da rilevare alle parti molli che ricoprono il cranio che si presentava integro con la dura madre non aderente di aspetto e spessore normale; Intensa la congestione meningo-encefalica.
Cervello, cervelletto, bulbo e ponte in sezione non rivelavano lesioni e si confermava la diffusa congestione. All’apertura della cavità toracica veniva repertato in entrambi i cadaveri la presenza di liquido siero-emorragico.
Modesti i versamenti nel cavo pericardico e in quelli pleurici.
Il cuore aumentato di volume si presentava di aspetto globoso per sfiancamento del ventricolo destro con il miocardio piuttosto flaccido, congesto e con segni di miocardosi.
I polmoni espansi, di colorito rosso-cianotico apparivano edematosi senza essere in preda a processi flogistici. Al taglio non si apprezzavano lesioni a focolaio, ma un’abbondante infiltrazione di liquido schiumoso, rossastro che diffondeva anche in bronchi e trachea.
Tutti questi riscontri a livello di cuore e polmoni risultavano più appariscenti nella cagna giovane rispetto al cadavere della madre.
All’apertura della cavità addominale si rinveniva un limitato versamento siero-emorragico con sierosa peritoneale liscia, lucente e vasi mesenterici fortemente iniettati.
Il fegato, congesto, aumentato di volume, evidenziava in superficie minute aree giallastre sparse, di aspetto distrofico, particolarmente evidenti (0.5-1 cm di diametro) nell’animale giovane che venivano confermate anche alla sezione di taglio.
La cistifellea appariva ripiena di bile fluida color giallo-verdastro.
Fenomeni di congestione erano evidenti nei due animali a carico della milza discretamente megalica, che al taglio presentava la polpa rossa ben trattenuta, i follicoli malpighiani e la trabecolatura poco appariscenti.
Nulla di patologico, macroscopicamente visibile a carico del pancreas, tranne un’intensa congestione.
Lo stomaco dilatato era parzialmente ripieno di materiale alimentare indigerito asciutto, rappresentato da penne, piume, zampe di volatili (verosimilmente tacchinotti) nella madre, mentre nello stomaco della figlia si rinveniva analogo contenuto, sempre ricco di piume ma abbastanza fluido. A livello intestinale il tenue si presentava vuoto mentre il grosso intestino evidenziava feci poltigliose bruno-verdastre senza rinvenire masse fecali formate.
I reni apparivano congesti, di consistenza e volume normali, facilmente scapsulabili. Al taglio non si apprezzavano lesioni.
Anche le surrenali risultavano congeste senza manifestare almeno macroscopicamente alcunchè di patologico. La vescica non conteneva urina e non evidenziava fenomeni patologici. Da segnalare che nella carcassa della madre più manifesti apparivano i fenomeni autolitici a livello parenchimale, dal momento che l’esame necroscopico è stato effettuato circa 72 ore dopo la morte della cagna.
Eseguite le necroscopie si provvedeva ad effettuare prelievi di porzioni di organi (polmone, rene, fegato, milza, surrenali, pancreas, encefalo e midoolo spinale) per effettuare indagini istopatologiche, seguendo le comuni tecniche di fissazione (formalina 10%), di paraffinazione e di colorazione (PAS, ematossilina-eosina, Van Gieson, Luxol Fast blue) ed indagini immunoistochimiche solo su campioni di midollo spinale, previamente congelati in isopentano preraffreddato, utilizzando un anticorpo monoclonale specifico biotinilato anti-acetilcolintransferasi (anti-ChAT, clone 11-255 Boehringer Mannheim), visualizzato con il complesso ABC-perossidasi, seguendo la metodica ottimizzata dalla casa produttrice.
Considerato il sospetto di intossicazione da fitofarmaci, ed in particolare da insetticidi organofosforici o da carbammati, si procedeva a prelevare in toto il materiale alimentare presente nello stomaco dei due soggetti a raccoglierlo in due distinti sacchetti di plastica per poi congelarlo a -18° C.
Successivamente il suddetto materiale veniva inviato al laboratorio chimico dell’Istituto di Medicina Legale e Assicurazioni del nostro Ateneo perché, su specifica nostra richiesta, provvedesse alla ricerca degli antiparassitari testé accennati.
I quadri morfologici osservati istologicamente sui campioni di organi prelevati ripetevano globalmente con assoluta costanza gli stessi aspetti in tutti e due i casi.
A livello polmonare l’esame microscopico rivelava aspetti di edema polmonare associato a fenomeni congestizi, confermando il quadro macroscopico.
In ambito epatico le sezioni allestite mostravano quadri di congestione associati ad aree in preda a distrofia ipossica epatocitaria. La PAS dimostrava scarsa reattività, particolarmente accentuata nella zona periferica del lobulo.
Il rene, oltre all’aspetto congestizio, mostrava sofferenze glomerulari e fenomeni di degenerazione vacuolare ed idropica a carico dell’epitelio tubulare, interessando prevalentemente la parte prossimale dei tubuli contorti e meno intensamente quella dei tubuli retti.
Nel surrene gli aspetti osservati, al di fuori di una discreta congestione vasale, non presentavano particolari scostamenti dalla norma nell’aspetto cromatico e morfostrutturale.
Anche nelle sezioni istologiche della milza e del pancreas non si rilevano apprezzabili differenze morfologiche rispetto alla norma, se non il prevalere di una condizione congestizia generalizzata.
A carico dell’encefalo del midollo spinale nulla di particolarmente anomalo da segnalare se non quadri di congestione vasale diffusa.
Per quanto attiene l’esame del midollo spinale delle due cagne intossicate la reazione immunoistochimica è parsa sempre molto tenue (foto 1) e comunque decisamente inferiore a quella ottenuta nei controlli (foto 2), utilizzando in quest’ultimo caso sezioni di midollo di cani morti per altre cause non coinvolgenti il midollo spinale.
Foto 1. Debole reazione immunoistochimica all’anticorpo anti-acetilcolintransferasi (anti-ChAT) osservata a livello di midollo spinale della madre (200 X).
In alcune sezioni, sempre dei soggetti in esame, la reattività è stata quasi del tutto negativa.
Foto 2. Normale reazione immunoistochimica all’anticorpo anti-acetilcolintransferasi (anti-ChAT) osservata a livello di midollo spinale di controllo (200 X).
Seguendo le tecniche ufficiali di analisi previste dalle normative vigenti per la ricerca di pesticidi su materiali omogenati acidificati ed estratti con cloroformio i riscontri di carbammati eterociclici ed in particolare del methomyl (S-metil N-metilcarbamoil-ossi tioacetimidato) sono risultati positivi. Più specificamente veniva osservata la presenza massiva di methomyl nel campione prelevato dallo stomaco della madre ed in tracce in quello della figlia (vedi figure 1 e 2). Data la natura chimica del gruppo attivo, il dato qualitativo, anche a detta del responsabile del laboratorio di tossicologia dell’Istituto di Medicina Legale del nostro Ateneo che ha eseguito le analisi, può essere considerato sufficiente per la formulazione di una corretta diagnosi di avvelenamento da methomyl, trattandosi di un tossico particolarmente potente (V classe).
Negativa è risultava la ricerca di composti organofosforici nei campioni esaminati.
Figura 1. Profilo GC di una miscela standard di methomyl
Figura 2. Profilo GC di una miscela standard di methomyl nel contenuto gastrico della cagna madre
Nel contesto presente, sulla base delle valutazioni anamnestiche, sintomatologiche, necroscopiche, immunoistochimiche e tossicologiche si può con certezza diagnostica affermare che i due cani esaminati sono morti per intossicazione acuta da methomyl, un carbammato molto usato in agricoltura.
Chiara ed evidente l’eziologia dell’avvelenamento riscontrato, le cui modalità di insorgenza sono da correlare al fatto che recentemente e a più riprese erano state poste in atto irrorazioni di methomyl. nel frutteto confinante con il recinto in cui erano tenuti i cani.
In tale terreno occasionalmente sono presenti anche alcuni tacchinotti sfuggiti alla sorveglianza del proprietario. Tali tacchinotti, si sono intossicati per esposizione diretta o verosimilmente per ingestione del fitofarmaco, venendo ben presto a morte e risultando facile preda dei cani, voraci, che incidentalmente sono transitati nel frutteto.
I cani dopo avere divorato i tacchini si sono a loro volta intossicati e sono deceduti.
A conclusione del nostro lavoro vogliamo sottolineare come i due casi di intossicazione acuta da methomyl descritti nei loro aspetti macro e microscopici e per le modalità con le quali si sono verificati assumono un certo interesse pratico per la scarsa documentazione in questo senso rilevata in letteratura ma soprattutto perché vuole richiamare l’attenzione e far riflettere sui rischi cui possono andare incontro l’uomo e gli animali che vivono o transitano in vicinanza di terreni irrorati di recente con siffatti pesticidi.
RIASSUNTO. L’autore, dopo aver esaminato i dati riportati in letteratura sull’intossicazione acuta da carbammati eterociclici espone i quadri anatomopatologici, macro e microscopici, osservati in due cani venuti accidentalmente a morte per aver ingerito methomyl.
SUMMARY. The authors, after considering literature data on eterocyclic carbamate poisoning, describe macroscopic and microscopic lesions in two dogs, died for fortuitous methomyl ingestion.
Si ringrazia, per la preziosa collaborazione, il Dott. B. Bernardelli dell’Istituto di Medicina Legale e delle Assicurazioni - Facoltà di Medicina e Chirurgia - Università degli Studi di Parma.
BIBLIOGRAFIA