Brindani F**, Bacci C.***
**: Istituto di Diagnostica e Tossicologia Sperimentale Veterinaria, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Parma. Tel. 0521-032764, Fax. 0521-032772, e-mail: brindani@ipruniv.cce.unipr.it.
***: Biologo.
Le spezie sono sostanze di origine vegetale che si distinguono per il loro caratteristico aroma e, grazie alle loro proprietà aromatiche, antiossidanti e conservanti, vengono ampiamente utilizzate nell'industria alimentare e farmaceutica. L'uso delle spezie è antichissimo: già i Romani erano soliti impiegarle, sfruttandone l'azione antifermentante, nei succhi di frutta (18).
In questi ultimi tempi una serie di motivazioni ha attirato nuovamente l'interesse del consumatore nei confronti delle spezie. Tra queste va annoverata la particolare attenzione che si evidenzia nei confronti degli alimenti "genuini", accentuata dalla sfiducia verso conservanti ed additivi sintetici. La sostituzione di questi ultimi con le spezie determina, quindi, una maggiore propensione nei riguardi del prodotto. Ipertensione e necessità di diete ipocaloriche inducono, poi, alla limitazione dei quantitativi di sale e di zucchero da addizionare agli alimenti. Infine, va ricordato che determinate spezie modificano la flora batterica intestinale con conseguente minore evenienza di fermentazioni indesiderate e, secondo taluni, anche con minore incidenza di neoplasie (25). Comunque, solo poco più di una decina, dei numerosi tipi di spezie conosciuti, è, attualmente, utilizzata con relativa frequenza.
I principi attivi delle spezie sono contenuti negli oli essenziali che si presentano come liquidi più o meno vischiosi e volatili, con composizione chimica variabile a seconda della spezia, e con una costante presenza di composti fenolici e dei loro esteri (21).
Le esperienze condotte in questo settore hanno evidenziato che gli oli essenziali delle spezie agiscono sui microrganismi durante le varie fasi dello sviluppo, anche se l'azione inibente risulta particolarmente intensa durante la fase di adattamento (fase LAG) e quella di crescita esponenziale, aumentando la durata della prima e riducendo quella della seconda (2, 4, 14).
Alla luce di queste considerazioni ci è parso interessante verificare la sensibilità di alcuni microrganismi patogeni (Bacillus cereus produttore di enterotossina e Yesinia enterocolitica sierotipo O:3) agli oli essenziali delle spezie, determinando, per alcune di esse, anche i dosaggi minimi inibenti (MCI) e minimi letali (MCL) nei confronti dei microrganismi considerati.
B. cereus è un batterio Gram positivo, aerobio, sporigeno, a diffusione ubiquitaria, presente nel terreno, sui vegetali e nell'intestino dell'uomo: più del 10% della popolazione adulta, in buona salute, ne risulta portatore a livello intestinale (15). Esso può essere in grado di indurre sia una sindrome emetica, di recente segnalazione (1975), sia una forma enterica, nota già da svariati decenni, ma ben documentata solo negli anni '70 (15, 23).
In questi ultimi anni si è assistito ad un incremento delle segnalazioni che vedono coinvolto tale batterio. Accanto ad un indubbio miglioramento delle metodiche di isolamento (11, 12, 19, 24), altri fattori paiono rivestire importanza nella accresciuta frequenza di questi episodi: l'abitudine di consumare alimenti già preparati e la diffusione della ristorazione collettiva, conseguenza dei moderni ritmi di lavoro (13).
Y. enterocolitica, riconosciuta come patogeno sin dal 1939, è un microrganismo Gram negativo, psicrofilo, di cui si conoscono una quarantina di sierotipi. Soltanto alcuni di essi (O:3, O:5, O8, O:9, O:27) risultano patogeni per l'uomo. Il sierotipo O:3, di frequente segnalazione nel suino (7, 8), è, indubbiamente, uno di questi. Nell'ambito delle sindromi enteriche le yersiniosi occupano un posto di rilievo collocandosi tra le quattro più diffuse a livello mondiale (16). La sindrome indotta dal microrganismo, in seguito all'elaborazione di una tossina termostabile, è costituita da coliche violente, diarrea, talora emorragica, vomito e febbre.
Stipiti batterici
Lo stipite di B. cereus oggetto della presente indagine è stato isolato da una confezione di formaggio grattugiato, reperita nella normale rete distributiva, ed identificato tramite l'esecuzione dei consueti test biochimico-enzimatici (17, 20, 22). Di tale ceppo sono state accertate sia le attitudini psicrofile sia la capacità di elaborare enterotossina (> 2 ng/ml), mediante il metodo di agglutinazione passiva inversa al lattice (3, 10), fornito in kit dalla Unipath.
Lo stipite di Y. enterocolitica sierotipo O:3, isolato nel corso di controlli routinari da salsicce fresche di suino, proviene dall'Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia, Sezione di Reggio Emilia.
Test di sensibilità agli oli essenziali
E' stato innanzitutto eseguito un iniziale screening tendente a valutare, anche se con una certa approssimazione, l'azione antimicrobica esercitata nei confronti degli stipiti batterici dai vari oli essenziali (reperiti presso l'erboristeria Solimè di Reggio Emilia). Veniva seguita, a tal fine, la metodica già utilizzata in una precedente ricerca (5), impregnando con 20 ml di olio essenziale dischetti di carta del diametro di 6 mm che venivano posti su piastre di Brain Heart Infusion (BHI: Oxoid) agarizzato, in precedenza insemenzate con quantitativi standardizzati dei ceppi in questione. Dopo incubazione a 30° C per 18-24 ore venivano rilevati gli aloni di inibizione; sulla base dell'estensione di questi è stato, quindi, possibile suddividere, sia pure arbitrariamente ed in modo approssimativo, gli oli come inibenti deboli, medi e forti.
Individuazione delle minime concentrazioni inibenti (MCI) e delle minime concentrazioni letali (MCL) negli stipiti prima e dopo il congelamento.
Si è proceduto alla determinazione della minima concentrazione inibente (MCI) e della minima concentrazione letale (MCL) di un olio per ognuna delle tre classi di sensibilità in precedenza individuate. Come inibente debole è stato scelto l'olio di noce moscata, come inibente di media intensità l'olio di coriandolo ed infine come forte quello di origano. Si è proceduto, poi, come consigliato da Davidson e Parisch (6), utilizzando la tecnica della diluizione scalare dei vari oli essenziali in volumi standard di etanolo (0,1 ml), aggiungendo ad essi le brodocolture degli stipiti da saggiare standardizzate alla concentrazione di 5 x 105 ufc/tubo (5 ml). Come controllo venivano addizionati 0,1 ml di alcool etilico alla sospensione batterica standardizzata. Tali brodocolture erano poi incubate a 30° C per 48 ore.
Dai tubi nei quali, dopo aggiunta dell'inibente, non si evidenziava, mediante conta su piastra (BHI agarizzato a 30° C per 48 ore), ulteriore sviluppo batterico, veniva prelevato un quantitativo costante (0,5 ml) di coltura che era trasferita in un uguale mezzo colturale, privo di inibenti, ed incubata sempre a 30° C per 24, 48 o 72 ore. Si procedeva, in tal modo, ad un trattamento di rivitalizzazione avente lo scopo di favorire la riparazione dei sistemi enzimatici parzialmente danneggiati dal contatto con l'olio. Era così possibile valutare se l'azione dell'olio essenziale, a determinate concentrazioni, aveva esercitato, sui microrganismi in questione un effetto inibente o letale. Analogo procedimento veniva adottato per gli stessi stipiti sottoposti in precedenza a congelamento lento a -18° C per 30 giorni, al fine di individuare un'eventuale differente sensibilità agli oli essenziali attribuibile a qualche danno strutturale o metabolico provocato dal trattamento, tendente a simulare le condizioni in cui potrebbero trovarsi i microrganismi presenti in alimenti conservati nei freezer domestici. In effetti il congelamento lento si rivela per i microrganismi (in particolar modo per i Gram negativi) di gran lunga più lesivo di quello rapido (1).
Grazie all'esito del test iniziale (tabella n. 1) è stato possibile individuare differenti livelli di intensità dell'attività inibitoria esercitata dagli oli essenziali. Sulla base dell'estensione degli aloni di inibizione (da 0 a 20 mm) tali oli sono stati valutati come inibenti forti (>10-20 mm), di media intensità (>5-10 mm) e deboli (0-5 mm).
Premettendo che Y. enterocolitica si è rivelato, costantemente, più sensibile alle varie spezie rispetto a B. cereus, dall'esame della tabella prima ricordata, è possibile rilevare che basilico, salvia, zenzero e noce moscata appaiono deboli inibenti nei confronti di entrambi gli stipiti saggiati; coriandolo, finocchio e maggiorana possono considerarsi di media intensità, mentre cannella, origano e timo evidenziano un forte potere inibente; l'olio di chiodi di garofano, infine, si comporta come un inibente medio per B. cereus e di spiccata efficacia per Y. enterocolitica.
I risultati forniti dalla determinazione delle MCI e delle MCL, relative agli oli essenziali di origano, coriandolo e noce moscata, riportati nella tabella n. 2, consentono di confermare la diversa intensità di azione da parte degli oli considerati, diversità che risulta molto più marcata di quanto già evidenziatosi nello screening iniziale, nei confronti del ceppo Gram negativo.
Il confronto tra i valori delle MCI e delle MCL, relative agli stipiti congelati e non, evidenzia una generalizzata diminuzione dei quantitativi di olio essenziale necessari per determinare l'inibizione e la morte dei ceppi sottoposti a congelamento (figure nn. 1, 2, 3 e 4). Solamente per l'olio di origano, nei confronti di B. cereus, non si rilevano variazioni.
Relativamente ai ceppi sottoposti a congelamento, risulta meno evidente la differenza dell'intensità di azione tra l'inibente considerato medio (coriandolo) e quello debole (noce moscata), risultando l'azione di quest'ultimo più marcata nei confronti di entrambi gli stipiti. Y. enterocolitica, inoltre, avendo subito rispetto a B. cereus un danneggiamento maggiore, probabilmente in relazione alla differente struttura degli involucri esterni, propria dei batteri Gram negativi, appare sensibile anche a dosaggi decisamente modesti di olio essenziale (MCI: 20-150 mg/ml; MCL: 100-1.000 mg/ml).
I risultati della nostra esperienza pongono in risalto la spiccata efficacia dell'olio essenziale di origano (inibente forte) verso Y. enterocolitica; i dosaggi rivelatisi inibitori e letali (50 e 250 mg/ml) sono sovrapponibili a quelli da noi rilevati in precedenti ricerche relative ad altri microrganismi, pure Gram negativi (5). Analoga corrispondenza con Aeromonas spp. è stata, inoltre, osservata relativamente ad un inibente debole, l'olio di noce moscata (1.100 e 10.500 mg/ml).
E' stato possibile evidenziare, anche, una notevole differenza tra i dosaggi richiesti per inibire i microrganismi considerati e quelli necessari per eliminarli. Tale divario si accentua particolarmente per B. cereus. Questo microrganismo, la cui presenza è stata a volte segnalata in alcune spezie (9), si è dimostrato molto più resistente di Y. enterocolitica nei confronti degli oli saggiati: l'olio di origano, che è apparso come il più attivo, risulta letale solamente a una concentrazione di 25.000 mg/ml.
Il congelamento, cui sono stati sottoposti i microrganismi, ha indubbiamente potenziato l'efficacia sia inibente sia letale di tutti i tipi di olio utilizzati. Ciò fa ritenere non inverosimile che l'aggiunta di determinate spezie, organoletticamente compatibili, possa inibire batteri, in particolare Gram negativi, presenti in alimenti utilizzati dopo scongelamento. Per ottenere, invece, un'azione letale, in particolare nei confronti di B. cereus, si rendono necessari, invece, dosaggi talmente elevati che potrebbero non essere tollerati da parte del consumatore.
Parole chiave: Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, inibizione, spezie.
Keywords: Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, inhibition, spices.
Schlusselworte: Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Hemmung, Gewuerze.
Riassunto - E' stata valutata la sensibilità agli oli essenziali di undici spezie da parte di Yersinia enterocolitica (sierotipo O:3) e di Bacillus cereus enterotossigeno, isolati rispettivamente da salsicce fresche di suino e da confezioni di formaggio grattugiato. Un primo screening ha consentito di individuare notevoli differenze nei livelli di attività inibitoria da parte degli oli considerati, nonché una costante maggior sensibilità a questi da parte di Y. enterocolitica. Successivamente venivano determinati i valori delle minime concentrazioni inibenti (MCI) e letali (MCL) di tre oli essenziali (origano, coriandolo e noce moscata) caratterizzati, rispettivamente, da un'azione inibente forte, media e debole. I valori ottenuti, per MCI e MCL, oscillavano da 250 a 2.500 mg/ml e da 25.000 a più di 60.000 mg/ml per B. cereus, mentre per Y. enterocolitica variavano da 50 a 1.100 e da 250 a 10.500 mg/ml. Tali determinazioni erano ripetute dopo aver sottoposto i ceppi a congelamento lento a -18° C per 30 giorni. In queste condizioni si evidenziava, con la sola eccezione dell'origano nei confronti di B. cereus, una generalizzata diminuzione delle MCI e delle MCL. Y. enterocolitica, inoltre, si rivelava particolarmente sensibile anche a dosaggi modesti (MCI: 20-150 mg/ml; MCL: 100-1.000 mg/ml) rispetto a B. cereus (MCI: 250-1500 mg/ml; MCL: 25.000-40.000 mg/ml).
SUMMARY - Yersinia enterocolitica (serotype O:3) and enterotoxigenic Bacillus cereus isolates from fresh pork sausages and ready-made grated cheese were assayed for susceptibility to the essential oils of eleven spices. Considerable differences in the levels of inhibitory activity of the oils taken into consideration were observed during the first screening. Moreover, a constantly higher susceptibility to these spices was shown by Yersinia enterocolitica. Subsequently, the values of the minimum inhibitory (MIC) and lethal (MLC) concentrations were determined for three essential oils (origan, coriander and nutmeg) characterised, respectively, by a strong, medium and weak inhibitory action. The values obtained for MIC and MLC varied from 250 to 2,500 mg/ml and from 25,000 to more than 60,000 mg/ml for B. cereus, while they ranged from 50 to 1,100 and from 250 to 10,500 mg/ml for Y. enterocolitica. The same procedure was repeated after freezing the strains slowly at -18° for 30 days. Under these circumstances the values for MIC and MLC generally decreased, with the only exception of B. cereus to origan. Moreover, Y. enterocolitica was particularly susceptible even to small quantities (MIC: 20 - 150 mg/ml; MLC: 100 - 1,000 mg/ml) unlike B. cereus (MIC: 250 - 1,500 mg/ml; MLC: 25,000 - 40,000 mg/ml).
ZUSAMMENFASSUNG - Yersinia enterocolitica (Serotypus O:3) und enterotoxigenisches Bacillus cereus, die aus frischer Schweinewurst und aus verpacktem geriebenem Kaese isoliert wurden, wurden fuer die Empfindlichkeit gegen aetherische Öele von 11 Gewuerze bewertet. Groeße Unterschiede in der Hemmungsaktivitaet der erwaegten Oele wurden waehrend des ersten Screenings beobachtet. Außerdem zeigte Yersinia enterocolitica eine staendig hoehere Empfindlichkeit gegen diese Gewuerze. Spaeter wurden die Werte von den mindesten hemmenden (MHK) und toedlichen (MTK) Konzentrationen fuer drei aetherische Oele (Origanum, Koriander und Muskatnuß) bestimmt. Bezeichnend fuer diese drei Oele ist eine beziehungsweise starke, mittlere und schwache Hemmungsaktivitaet. Die fuer MHK und MTK erreichten Werte schwankten zwischen 250 und 2,500 ìg/ml und zwischen 25,000 und mehr als 60,000 ìg/ml fuer B. cereus und fuer Y. enterocolitica von 50 zu 1,100 und von 250 zu 10,500 mg/ml . Dasselbe Verfahren wurde nach langsamem Gefrieren (- 18° Grad fuer 30 Tage) der Staemme wiederholt. Normalerweise verkleinerten sich die Werte fuer MHK und MTK unter diesen Bedingungen, mit der einzigen Ausnahme von B. cereus gegen Origanum. Außerdem war Y. enterocolitica besonders empfindlich sogar gegen kleine Mengen (MHK: 20 - 150 ìg/ml; MTK: 100 - 1,000 ìg/ml) anders als B. cereus (MHK: 250 - 1,500 mg/ml; MTK: 25,000 - 40,000 ìg/ml).
Bibliografia