Pier Luigi Dodi1
(1) Istituto di Clinica Medica Veterinaria dell'Università di Parma.
L'elettrofisiologia dell'apparato visivo è il settore della semeiotica oculare che studia i fenomeni elettrici che si verificano a livello retinico. Infatti, gli eventi bioelettrici oculari possono essere registrati analogamente a quanto avviene per cuore e cervello.
Se si posiziona un elettrodo sulla cornea e un altro elettrodo di riferimento in una qualunque zona della testa si può misurare una differenza di potenziale di diversi millivolt, chiamato potenziale di riposo o "standing potential". Se lo stesso occhio è sottoposto ad uno stimolo luminoso si originerà un potenziale di massa (dato dalla somma di molte cellule) che costituisce l'ERG (Cordella e coll., 1991). L'ERG è uno dei più antichi potenziali biologici, già nel 1849 un ricercatore tedesco registrò una differenza di potenziale fra la cornea e l'estremità recisa del nervo ottico in un pesce.
L'ERG è una tecnica elettrodiagnostica scarsamente invasiva utilizzata in oftalmologia per la diagnosi delle patologie retiniche che coinvolgono fotorecettori (coni e bastoncelli), cellule dello strato bipolare e cellule di Müller. E' di fondamentale importanza nella valutazione della funzionalità retinica nei soggetti con cataratta e/o opacamento della cornea prima di un eventuale intervento chirurgico. In questi casi l'opacamento dei mezzi diottrici impediscono l'esame diretto del fondo oculare.
Altro campo applicativo è quello della diagnosi precoce delle malattie retiniche ereditarie quali: "Progressive Retinal Atrophy" PRA e "Sudden Acquired Retinal Degeneration" SARD, in quanto all'esame oculare diretto non può essere rilevata alcuna lesione in modo particolare nelle fasi iniziali delle patologie retiniche. Per queste retinopatie l'ERG è l'unico strumento diagnostico attualmente disponibile. L'ERG non è un test visivo ma valuta l'integrità funzionale della retina, infatti a seguito della recisione del nervo ottico il tracciato elettroretinografico rimane del tutto inalterato. L'ERG è il risultato dell'attività globale di tutte le cellule delle retina e dell'epitelio pigmentato (Clerc, 1997) e non può diagnosticare lesioni focali (Slatter, 1990). Scopo della presente nota è quello di illustrare le recenti tecniche elettroretinografiche.
La retina è una parte specializzata del Sistema Nervoso Centrale costituita da una complessa struttura fotosensoriale multistratificata che delimita il segmento posteriore dell'occhio (Millichamp, 1992). E' di origine embriologica neuroectodermica, rappresenta una reale invaginazione del sistema nervoso collegata al cervello attraverso il nervo ottico (II NC), e si estende dall'entrata del disco al margine pupillare dell'iride. E' possibile dividerla in due porzioni: la porzione prossimale, che va dalla papilla all'equatore, costituisce la parte ottica della retina, dove si trovano gli elementi nervosi, e la porzione distale che non contiene fotorecettori. Lo spessore nel cane varia da 0,24 mm nella porzione centrale a 0,12 mm in quella periferica (Magrane, 1971). Istologicamente è formata da due lamine intimamente unite: quella esterna costituita da cellule pigmentate, definita retina pigmentata, e quella interna propriamente nervosa, costituita da nove strati di cellule. La connessione nervosa è organizzata su una catena di tre elementi di cellule nervose. Procedendo dalla parte periferica troviamo le cellule dei coni e bastoncelli, le cellule bipolari, le cellule multipolari e le cellule traversali. I fotorecettori appoggiano sull'epitelio pigmentato della retina (EPR), uno strato di cellule piatte di forma poligonale sito tra coroide e strato dei fotorecettori. Le cellule dell'EPR hanno diverse ed importanti funzioni quali il trasporto dei nutrienti tra la coroide e gli strati più esterni della porzione neurosensoriale retinica, la fagocitosi e il mantenimento della retina adesa attraverso la creazione di un gradiente di corrente di liquido all'interno dello spazio sub-retinico (Komaromy e coll., 1998/a). Tra epitelio pigmentato della retina e retina si frappone uno spazio virtuale, definito spazio sub-retinico, sede di possibile distacco o separazione retinica.
I fotorecettori (bastoncelli e coni) costituiscono lo strato più esterno della retina neurale. I bastoncelli, più stretti e lunghi dei coni, sono molto sensibili alla luce e pertanto risultano di fondamentale importanza per la visione notturna o crepuscolare (visione scotopica). I coni invece sono poco sensibili alla luce e la loro funzione principale é quella della differenziazione dei dettagli e dei colori (visione fotopica) (Stades, 1998). Il segmento più esterno dei coni e dei bastoncelli contiene molecole di pigmento che assorbono luce (rodopsina nei bastoncelli) in dischetti costituiti da una doppia membrana (Komaromy e coll., 1998/a). Nel cane la maggiore concentrazione di coni si trova nell'area centrale della retina, temporalmente al disco ottico (Koch, 1972). I bastoncelli sono più numerosi dei coni e si localizzano nell'area della periferia retinica. Nel cane nessuna parte della retina è libera da bastoncelli (come nella regione maculare dell'uomo).
La nutrizione della retina è garantita dalla coroide sottostante (seconda tunica oculare) e dai vasi della retina. Il contributo nutrizionale della coroide è fondamentale per il terzo esterno della retina in quanto la retina esterna non è irrorata da vasi sanguigni. Perciò questi strati ricevono ossigeno e nutrienti dalla coroide primariamente per diffusione. Ecco perché in caso di distacco di retina si ha atrofia delle cellule retiniche (a-Komaromy, 1998). La vascolarizzazione retinica vera e propria è assicurata dalle arterie e vene ciliari posteriori brevi, che si anastomizzano a livello del disco ottico a formare il circolo vascolare del nervo ottico, incompleto, da cui emergono quattro arteriole e venule principali (Lignereux, 1997) che si dispongono a epsilon rovesciata. Dalle arteriole e venule dipartono molti capillari microscopici che si distribuiscono nei diversi strati retinici. Nel cane, come negli altri animali e a differenza nell'uomo e dei primati, non esiste un'arteria centrale della retina (Monti, 1985).
Alla nascita la retina non è totalmente sviluppata, infatti la completa maturità morfologica nel cane si ha dalla sesta, settima settimane di vita (Aguirre, 1972). Una struttura cellulare extraretinica di fondamentale importanza per la visione notturna è il tapetum lucidum; é situato nello spessore della coroide, tra la coriocapillare e lo strato dei grandi vasi della coroide, ed ha una forma triangolare a base orizzontale. Il tapetum è assente nei soggetti albini e nei neonati in cui si sviluppa dopo la nascita (Monti, 1985). Nel cane è costituito da 9-20 strati di cellule altamente organizzate al cui interno vi sono cristalli ad alto contenuto di zinco, cisteina (Miller e coll., 1995) e riboflavina. All'esame oftalmoscopico è visibile nel quadrante dorsale del fondo oculare con colori che variano da verde, blue e giallo a seconda della specie, razza ed età (Peiffer e coll., 1997).
La funzione del tapetum è quella di "amplificare" la luce (é il responsabile del fenomeno dell'abbagliamento degli occhi), per cui risulta indispensabile nelle condizioni di luminosità crepuscolare e notturna.
La fisiologia de retina è molto complessa ma lo studio dei processi che determinano la trasformazione della luce in corrente elettrica è di fondamentale importanza per comprendere i test elettrodiagnostici. La luce (fotoni) che colpisce la retina è assorbita dai fotorecettori che sviluppano una risposta elettrofisiologica definita fototrasduzione. Questo determina eccitazione ed inibizione delle cellule neurali che costituiscono la retina.
Nei fotorecettori si realizza il primo evento del processo visivo, la conversione del segnale luminoso in segnale elettrico neurale. Questo, attraverso lo strato delle cellule bipolari, arriva alle cellule ganglionari che rappresentano gli elementi di uscita della retina in quanto trasmettano alla corteccia, attraverso le fibre del nervo ottico, i segnali visivi (Cordella e coll., 1991). Le registrazioni di queste variazioni di potenziali di membrana nel tempo costituiscono l'Elettroretinogramma.
L'equipaggiamento necessario per l'esecuzione dell'esame elettroretinografico è costituito dagli elettrodi, da una fonte luminosa flash o fotostimolatore (lampada allo xenon) e da un apparecchio di amplificazione e registrazione del segnale.
Gli elettrodi sono conduttori metallici per mezzo dei quali è possibile trasferire il segnale bioelettrico all'amplificatore.
I materiali normalmente impiegati sono l'argento, l'argento cloruro, l'oro, il platino e il carbonio (fibra di carbonio). I primi tre materiali sono da preferirsi per le loro caratteristiche di conducibilità e stabilità. Gli elettrodi si dividono in sottocutanei o ad agoinfissione e corneali (Magni, 1999).
Gli elettrodi corneali sono di materiale plastico, hanno la forma di lente a contatto e contengono un sottile filo d'oro o d'argento. L'aderenza dell'elettrodo corneale è generalmente garantita da un materiale conduttivo biocompatibile interposto fra l'elettrodo e il tessuto. A tal fine normalmente è impiegata la carbossimetilcellulosa sodica. Gli elettrodi riutilizzabili devono essere puliti con molta attenzione e sterilizzati dopo ogni uso in quanto sono potenzialmente in grado di trasmettere eventuali agenti infettivi, inoltre residui di lacrime o sangue possono compromettere la corretta registrazione dell'ERG. I protocolli di lavaggio e sterilizzazione da utilizzare sono quelli consigliati dalle case produttrici. Prima di iniziare il test elettroretinografico è necessario misurare l'impedenza dell'elettrodo, questa valutazione si ottiene facendo passare una corrente di 1 o 2 microAmper fra l'elettrodo da valutare e l'elettrodo di terra; il valore di impedenza ottenuto che deve essere al di sotto di 5 KOhm.
Lo stimolatore è un flash allo xenon (stimolo diffuso) che è posto a 20 - 30 cm dall'occhio da esaminare. Il flash può essere variato in intensità (a seconda del tipo) e durata. Inoltre è possibile interporre dei filtri (neutro, rosso o blu). E' necessario porre molta attenzione nella calibrazione del fotostimolatore in quanto variazioni in uscita sono causa di artefatti. La condizione ottimale per la stimolazione flash é la stimolazione "Ganzfeld". Lo stimolo Ganzfeld è una illuminazione indiretta ed omogenea ottenuta in una semisfera (Sims, 1999). Lo stesso tipo di stimolo può essere in parte riprodotto applicando una semisfera ottenuta da una pallina da ping-pong direttamente sull'occhio dell'animale (Macaluso, 1999).
L'amplificatore è un dispositivo in grado di "moltiplicare" il voltaggio del segnale registrato, questo é necessario in quanto il potenziale retinico è molto piccolo, inferiore ad 1 mV (Sims, 1999). L'amplificatore oltre ad amplificare la reale differenza di potenziale fra due elettrodi registra molti altri potenziali presenti tra qualsiasi coppia di elettrodi e l'ambiente circostante, che costituisce il cosiddetto rumore. Il rumore è di alcuni ordini di grandezza più elevato del segnale biologico d'interesse e può arrivare fino a mascherarlo completamente (Cordella e coll., 1991). Per evitare questo è necessaria l'elaborazione del segnale biologico e l'impiego di amplificatori differenziali. L'ambiente dove viene eseguito il test deve essere privo di apparecchi radiologici, ascensori ecc. ovvero di qualsiasi sorgente possibile causa di disturbo. In alcuni casi la schermatura dell'ambiente risulta pertanto necessaria (Tabella 1).
Il paziente deve essere anestetizzato e la pupilla dilatata mediante l'instillazione di farmaci midriatici (Tropicamide 1%). L'anestesia del cane è richiesta per ottenere l'immobilità dell'animale e per evitare eventuali movimenti pupillari ed oculari volontari ed involontari che comportano artefatti ed interferenze nella registrazione. Il protocollo dell'anestesia è estremamente importante in quanto gli anestetici gassosi alotano e isofluorano possono determinare una depressione del tracciato ERG (Es. riduzione dell'ampiezza). Per questi motivi può essere sufficiente una forte tranquillizzazione. Nel cane la combinazione ketamina-xylazina ha dato buoni risultati (Sims, 1999).
Il primo elettrodo positivo (attivo) è una lente a contatto che viene applicata sulla superficie corneale previa interposizione di carbossipropilmetilcellulosa, un mezzo viscoso che garantisce una maggiore adesione ed impedenza (non vi devono essere bolle d'aria fra lente e cornea). Le palpebre sono tenute aperte grazie ad un blefarostato. Il secondo elettrodo negativo (reference electrode) è infisso nella cute "dietro l'occhio" lungo l'arco zigomatico, circa a metà distanza fra il canto laterale dell'occhio e la base del padiglione auricolare. Il terzo elettrodo, definito di terra (indifferente), è infisso nel sottocute nell'area temporale o frontale (Severin, 1996), applicato alla base dell'orecchio. Gli elettrodi ad agoinfissione sono introdotti tangenzialmente nella cute e vengono a contatto con i fluidi organici. I potenziali d'azione sviluppati vengono registrati dall'elettroretinografo. La retina è stimolata sia dopo l'adattamento al buio (scotopico), sia alla luce (fotopico). La stimolazione luminosa può essere variata in intensità, colore e frequenza ed in questo modo può essere selettiva sull'attività dei coni o bastoncelli. Il tipo e la qualità della luce è modificata attraverso l'uso di filtri bianchi, blu e rossi. La luce bianca stimola sia i coni che i bastoncelli, la blu stimola solo i bastoncelli, quella rossa i coni anche se nel cane lo spettro della luce rossa risulta poco significativo (Clerc, 1997). Lo stimolo flicker (30 Hz) valuta la capacità della retina a rispondere a stimolazioni luminose veloci ed intermittenti. L'attività dei coni e dei bastoncelli può essere differenziata, variando intensità e frequenza dello stimolo, in quanto i bastoncelli rispondono a frequenze minori a 20 Hz, mentre i coni a frequenze di stimolazione superiori o uguali a 30 Hz (Mertel e coll., 1993)
Il tracciato elettroretinografico è costituito da tre onde: "a", "b" e "c", anche se per scopi clinici vengono considerate solo le prime due (Figura 1).
L'onda "a" si presenta come una deflessione negativa che riflette l'attività dei fotorecettori ed è il risultato di due onde: a1 e a2. La prima esprime l'attività dei coni (fotopica), la seconda quella dei bastoncelli (scotopica). Le due onde possono essere divise stimolando la retina con luce monocromatica con filtri rossi (coni) e blu (bastoncelli), al fine di individuare una deficienza di un tipo di cellule fotorecettoriali. Il culmine di tempo dell'"onda a" è di 12-14 ms e la sua ampiezza è di 12 mV. Questa è seguita dall'onda "b", positiva, che esprime la funzione delle cellule dello strato bipolare e di Müller, sulla sua porzione ascendente si identificano i potenziali oscillatori, rappresentati da piccole onde, in genere 5, che riflettono un'attività sinaptica nella retina interna (Mertel e coll., 1993). L' "onda b" e costituita da due componenti distinte: b1 che riflette l'attività fotopica e b2 che riflette quella scotopica. L'onda "c" è generata dall' epitelio pigmentato della retina (Clerc, 1997).
La valutazione clinica del tracciato elettroretinografico è immediata. I valori di riferimento utili per identificare una retinopatia devono essere determinati in ogni singola struttura. L'assenza dei valori normali delle onde elettroretinografiche è dovuto alla mancanza di procedure standard e alle differenti condizioni in cui operano i diversi laboratori (Tabella 2).
Prima di iniziare un esame elettroretinografico é bene avere un sospetto diagnostico per sapere cosa si va a cercare con l'esame elettrofisiologico. Solo così facendo è possibile arrivare ad una diagnosi. Quindi, segnalamento, anamnesi e visita clinica devono precedere il test elettroretinografico.
Lo studio elettrofisiologico delle vie ottiche risulta in molti casi di estrema importanza per indirizzare la diagnosi di alcune patologie. Esistono forme in cui l'aspetto clinico ed oftalmoscopico é chiaro ma in molti casi la diagnosi (specialmente nelle prime fasi o nelle forme precoci) risulta di estrema difficoltà. L'ERG consente l'analisi obiettiva funzionale della retina e trova quindi applicazione in tutte le patologie eredodegenerative, tossiche, vascolari, traumatiche ecc. che coinvolgono questa struttura (Tabella 3). L'ERG preoperatorio nei cani da sottoporre all'intervento di cataratta andrebbe sempre eseguito con luce bianca per valutare la funzione retinica (Clerc, 1997). La diagnosi attraverso l'ERG ci porta non solo ad un indirizzo terapeutico dove possibile, ma ci permette soprattutto di formulare una prognosi funzionale.
Parole chiave: cane, ERG, patologia retinica
Key words: dog, ERG, retinal disease
RIASSUNO - L'elettroretinografia è un valido aiuto per la diagnosi della cecità nel cane: patologie retiniche degenerative ereditarie. Al test devono essere sottoposti tutti gli animali prima dell'intervento di cataratta. Prima di iniziare il test e richiesta la dilatazione pupillare e l'adattamento al buio. Un elettrodo a forma di lente a contatto è posto sulla superficie corneale. L'elettrodo di referenza é posizionato dietro la testa mentre quello di terra é posto alla base dell'orecchio. Il potenziale d'azione è prodotto dal fotostimolatore. La retina è stimolata dopo l'adattamento al buio (scotopico) e alla luce (fotopico). Lo stimolo luminoso può essere variato in intensità, colore e frequenza. Il tracciato ottenuto è composto da 3 onde. La prima, negativa, "onda a" riflette l'attività dei fotorecettori, l'onda "b", positiva, che segue è data dallo strato intermedio, mentre l'"onda c" riflette l'attività dell'epitelio pigmentato. L'adattamento alla luce riflette la funzione dei coni, quello al buio dei bastoncelli. L'ERG è un test della funzionalità retinica, non è un test visivo.
SUMMARY - Electroretinography helps in differential diagnosis of blindness in animals: hereditary retinal diseases and degeneration. The test is support animal to be operated for cataracts. Before starting test pupils must be dilated and dark adaptation may be required. A contact lens electrode is applied to the eye surface. A reference electrode is applied to the forehead a ground to an earlobe. The action potential is produced by light stimulation. The retina is stimulated after either dark (scotopic) or light (photopic) adaptation. The light stimulus can be varied in intensity, color and frequency. The tracing is made up of 3 waves. The first negative deflection, named "a wave", reflects the outer retinal layer (photoreceptor) activity. The positive "b wave" follows and is generated by intermediate retinal layer. The "c wave" is generated by pigmented epithelium. The light adapted response primarily reflects cone functions. The dark adapted response is primarily from the rods. ERG is a retinal response not a visual test.
Riferimenti bibliografici