Obiettivi formativi
<p>Il corso intende fornire gli strumenti metodologici rivolti alla risoluzione di miscele di proteine e acidi nucleici e alla determinazione qualitativa e quantitativa di specifiche componenti di interesse nella diagnostica alimentare, basati sulle tecniche separative cromatografiche ed elettroforetiche, sulle tecniche di sequenziamento di proteine e DNA e sulle diverse tecniche immunologiche e di biologia molecolare. Sono inoltre descritte le tecniche di biologia molecolare utilizzate per l'ottenimento di organismi transgenici e di proteine ricombinanti di interesse nel settore agro-alimentare. Ampio risalto è dato agli enzimi e alle loro applicazioni analitiche e tecnologiche nell’ambito alimentare. </p>
Contenuti dell'insegnamento
Determinazione della composizione amminoacidica e della sequenza delle proteine. Determinazione della composizione amminoacidica delle proteine. Frammentazione delle proteine in peptidi. Separazione cromatografica, sequenziamento (Degradazione di Edman) e allineamento dei peptidi. Identificazione delle proteine mediante sequenziamento dell’estremità N-terminale e mediante analisi di banche-dati di sequenze di proteine e DNA. Determinazione e confronto delle sequenze amminoacidiche delle proteine mediante analisi di banche-dati di sequenze di proteine e DNA. <br />
Metodi separativi utilizzati per le proteine. Precipitazione differenziata delle proteine mediante modificazioni di pH, forza ionica e costante dielettrica del mezzo. Tecniche separative cromatografiche per le proteine: cromatografie ad interazione idrofobica, a scambio ionico, ad esclusione dimensionale e di affinità/immunoaffinità. Tecniche separative elettroforetiche per le proteine: elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE); focalizzazione isoelettrica; elettroforesi bidimensionale. <br />
Metodologie immunologiche. Cenni alle basi biochimiche della risposta immunitaria e alle proprietà strutturali/funzionali degli anticorpi. Preparazione di anticorpi policlonali e monoclonali. Utilizzazione degli anticorpi come reagenti analitici: immunoprecipitazione, immunodiffusione, immunoelettroforesi, Western Blotting, test immunoenzimatici (ELISA). <br />
Metodologie di biologia molecolare. Elettroforesi di acidi nucleici. Sequenziamento del DNA. Enzimi impiegati per la manipolazione del DNA. PCR e RT-PCR (reazioni a catena della DNA polimerasi) qualitative e quantitative. <br />
Enzimologia e sue applicazioni. Meccanismo d’azione degli enzimi: principali fattori della catalisi enzimatica. Cinetica enzimatica allo stato stazionario e determinazione di kcat, Km e kcat/Km. Tecnologia degli enzimi. a) Impiego degli enzimi a fini analitici. b) Applicazioni tecnologiche degli enzimi al settore alimentare. Degradazione dell’amido in zuccheri (amilasi e glucosio isomerasi), tecnologie lattiero-casearie (chimosina, proteasi, lipasi, lattasi, lisozima), sintesi di aspartame (termolisina), risoluzione di D- e L-amminoacidi (amminoacilasi). c) Inibitori enzimatici. Inibitori reversibili e irreversibili. Pesticidi come inibitori enzimatici. d) Denaturazione e stabilizzazione degli enzimi. <br />
Bibliografia
Wilson K., Walker J. Metodologia Biochimica. Raffaello Cortina Editore <br />
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Ninfa A.J., Ballou D.P. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli Editore <br />
Metodi didattici
<p>Lezione orale.</p>
<p>Esame orale.</p>
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