Obiettivi formativi
Il corso intende fornire gli strumenti metodologici rivolti alla risoluzione di miscele di proteine e acidi nucleici e alla determinazione qualitativa e quantitativa di specifiche componenti di interesse nella diagnostica alimentare, basati sulle tecniche separative cromatografiche ed elettroforetiche, sulle tecniche di sequenziamento di proteine e DNA e sulle diverse tecniche immunologiche e di biologia molecolare. Sono inoltre descritte le tecniche di biologia molecolare utilizzate per l'ottenimento di organismi transgenici e di proteine ricombinanti di interesse nel settore agro-alimentare. Ampio risalto è dato agli enzimi e alle loro applicazioni analitiche e tecnologiche nell’ambito alimentare
Contenuti dell'insegnamento
<p> Metodologie di biologia molecolare. Cenni su struttura degli acidi nucleici. Fusione e rinaturazione del DNA. Caratteristiche spettroscopiche degli acidi nucleici. Attività dei principali enzimi coinvolti nei processi di duplicazione e trascrizione. Estrazione, purificazione e quantificazione di DNA e RNA. Elettroforesi: principi generali. Elettroforesi di acidi nucleici. Attività dei principali enzimi impiegati per la manipolazione del DNA. Sequenziamento del DNA: metodo della degradazione chimica, metodo a terminazione di catena, sequenziamento a ciclo termico, utilizzo di marcatori fluorescenti per sequenziamenti automatizzati, pirosequenziamento. Principi e applicazioni della reazione a catena della DNA polimerasi (PCR). Progettazione dei primer. Nested PCR, multiplex PCR, reverse-transcription PCR, random amplification of polymorphic DNA (RAPD). PCR quantitativa: real time PCR, principi e applicazioni. Enzimi di restrizione e RFLP. Clonazione di geni esogeni in vettori plasmidici mediante l'impiego di enzmi di restrizione, mediante "T/A Cloning" e mediante "Bolcloning". Trasformazione di organismi ospiti e selezione dei ricombinanti. Metodologie impiegate nella preparazione di organismi transgenici di interesse nel settore agro-alimentare: mais Bt e soia RoundUp Ready. utilizzo di Agrobacterium tumefaciens. Silenziamento genico mediante tecnologia dell'RNA antisenso. Metodi di analisi per la presenza di OGM autorizzati e non autorizzati in prodotti alimentari. </p>
<p>Metodi separativi utilizzati per le proteine. Cenni su struttura di aminoacidi e proteine. Determinazione della concentrazione proteica. Estrazione di proteine da tessuti biologici. Precipitazione differenziata delle proteine mediante modificazioni di pH e forza ionica. Dialisi. Ultrafiltrazione. Tecniche separative cromatografiche per le proteine: cromatografie ad interazione idrofobica, a scambio ionico, ad esclusione dimensionale e di affinità/immunoaffinità. Tecniche separative elettroforetiche per le proteine: elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE); elettroforesi nativa; focalizzazione isoelettrica; elettroforesi bidimensionale. Metodi di rivelazione. <br />
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Metodologie immunologiche. Cenni alle basi biochimiche della risposta immunitaria e alle proprietà strutturali/funzionali degli anticorpi. Preparazione di anticorpi policlonali e monoclonali. Utilizzazione degli anticorpi come reagenti analitici: immunoprecipitazione, , immunoelettroforesi, Western Blotting, test immunoenzimatici (ELISA). Basi biochimiche della BSE e metodi di indagine. Patologie da "misfolding": la encefalopatia spongiforme bovina (BSE). <br />
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Enzimologia e sue applicazioni. Principali fattori della catalisi enzimatica. Meccanismi di catalisi enzimatica. Regolazione dell'attività enzimatica. L'esempio delle proteasi a serina. Cinetica enzimatica allo stato stazionario e determinazione di kcat, Km e kcat/Km. Inibitori enzimatici. Inibitori reversibili e irreversibili. Inibitori competitivi e non competitivi.Tecnologia degli enzimi. Applicazioni tecnologiche degli enzimi al settore alimentare: uso della beta-galattosidasi e sintesi dell'aspartame.Denaturazione e stabilizzazione degli enzimi. Preparazione di enzimi stabili: fissazione covalente e non covalente a supporto. Enzimi da microrganismi termofili. <br />
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Bibliografia
Wilson K., Walker J. Biochimica e Biologia Molecolare. Principi e tecniche. Raffaello Cortina Editore <br />
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Dale J.W., von Schantz M. Dai geni ai genomi. Edises Editore<br />
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Nelson D.L., Cox M.M.I principi di biochimica di Lehninger. Zanichelli Editore<br />
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Brown T.A. Biotecnologie Molecolari Principi e Tecniche. Zanichelli Editore <br />
