Obiettivi formativi
Durante questo corso, verranno fornite allo studente conoscenze
sistematiche sulle principali tecniche impiegate nel laboratorio di biochimica.
Le conoscenze impartite riguardano metodologie per l’identificazione, l’
isolamento, e lo studio strutturale e funzionale delle macromolecole
biologiche, nonché strumenti intellettuali per l'analisi dei risultati e per la
loro descrizione. Le conoscenze sono verificate nel corso di un esame orale.
Prerequisiti
Corsi di base in Fisica, Chimica e Biochimica
Contenuti dell'insegnamento
Proprietà di base delle proteine correlate con le Metodologie Biochimiche: punto isoelettrico (pI) delle proteine, solubilità delle proteine in funzione del pH e della forza ionica, “unfolding” delle proteine in presenza di agenti denaturanti (denaturazione acida, termica e da detergenti).
Frazionamento subcellulare mediante l’impiego di tecniche centrifugative.
Strategie usate per l’isolamento e la purificazione delle proteine ottenute da fonti naturali o in forma ricombinante.
Principi e applicazioni di metodologie di base dedicate alle proteine, sia a fini preparativi che analitici: tecniche spettroscopiche, elettroforetiche e cromatografiche.
Anticorpi: relazione struttura-funzione e risposta immunitaria. Antigeni ed apteni. Preparazione degli anticorpi monoclonali e policlonali. Le metodologie immunochimiche: immunoprecipitazione, tecniche ELISA e Western-blotting. Cenni sull’impiego degli anticorpi a scopo diagnostico e terapeutico.
Tecnologia degli enzimi. Metodi di determinazione dell’attività enzimatica. Analisi cinetica enzimatica allo stato stazionario (modello di Michaelis-Menten): determinazione di kcat, Km e kcat/Km, e correlazioni con le proprietà degli enzimi. Gli inibitori enzimatici reversibili ed irreversibili, e loro rilevanza biotecnologica (farmaci, pesticidi...). Esempi di utilizzo biotecnologico degli enzimi.
I radioisotopi come traccianti biologici.
Metodi di analisi delle interazioni ligando-proteina: titolazioni spettrofotometriche e fluorimetriche, tecniche centrifugative e di dialisi all’equilibrio. Metodi grafici per l’analisi delle interazioni ligando-proteina: Scatchard Plot e Hill Plot.
Metodi di analisi delle interazioni proteina-proteina e DNA-proteina: tecniche basate su cromatografia di affinità, saggi di complementazione di frammenti proteici (yeast two-hibrid), co-immunoprecipitazione, cross-linking di complessi proteina-proteina e DNA-proteina (chromatin-immunoprecipitation), cromatografia ad esclusione dimensionale, elettroforesi di DNA (band shift assay).
Principali metodologie usate negli studi di Proteomica.
Programma esteso
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Bibliografia
Bonaccorsi di Patti, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Casa Editrice Ambrosiana
Reed, Holmes, Weyers & Jones, Metodologie di base per le scienze
biomolecolari, Zanichelli
Metodi didattici
Lezioni orali, con l’impiego di mezzi multimediali. Sono inoltre previste visite nel laboratorio biochimico, nel corso delle quali gli studenti potranno assistere all’impiego di strumentazione di base riguardante: estrazione di proteine e DNA dalle cellule; separazione cromatografica di proteine; analisi elettroforetica di proteine e DNA; analisi spettrofotometrica di proteine.
Modalità verifica apprendimento
Le conoscenze acquisite e la capacità di utilizzarle in pratica saranno verificate attraverso un esame orale. In questa prova verrà valutata la capacità di esporre idee ed analisi con chiarezza e proprietà.
Altre informazioni
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