BIOCHIMICA APPLICATA
cod. 00062

Anno accademico 2008/09
3° anno di corso - Primo semestre
Docente
Settore scientifico disciplinare
Biochimica (BIO/10)
Field
Discipline biologiche e farmacologiche
Tipologia attività formativa
Caratterizzante
64 ore
di attività frontali
8 crediti
sede:
insegnamento
in - - -

Obiettivi formativi

Acquisizione delle conoscenze relative alle tecniche di base ed avanzate impiegate nell'isolamento e nella caratterizzazione delle macromolecole biologiche, con particolare attenzione al DNA e alle proteine. <br />

Prerequisiti

Biochimica

Contenuti dell'insegnamento

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1. Il laboratorio biochimico: rischio chimico e rischio biologico. Colture cellulari. Sterilizzazione dei materiali e mantenimento delle condizioni di sterilità.<br />
2. Tecnologie del DNA ricombinante: organismi ospite, endonucleasi di restrizione, DNA ligasi, vettori di clonaggio, plasmidi come vettori di clonaggio, selezione dei ricombinanti, alfa-complementazione, PCR, mutagenesi sito-specifica, DNA-microarrays, genoteche.<br />
3. Espressione di proteine ricombinanti: parametri che influenzano la quantità di proteina espressa, vettori di espressione, ceppi cellulari, promotori lac e T7, induzione dell’espressione, espressione cell-free, proteine di fusione. Le proteine ricombinanti come farmaci.<br />
4. Purificazione di proteine:<br />
* Tecniche di estrazione: metodi meccanici e metodi non meccanici.<br />
* Tecniche centrifugative: principi, tipi di centrifughe, sedimentazione differenziale, centrifugazione in gradiente.<br />
* Concentrazione delle soluzioni e cambio di tampone: ultrafiltrazione, dialisi, diafiltrazione.<br />
* Metodi di frazionamento: per stabilità e per solubilità (salting out, al pI e per addizione di solventi organici).<br />
* Cromatografia: principi e tecniche. C. a scambio ionico, c. ad interazione idrofobica, c. a fase inversa, c. ad esclusione dimensionale e sue applicazioni, c. d’affinità (IMAC, proteina A, GST)<br />
5. Tecniche elettroforetiche: principi e applicazioni alle macromolecole biologiche. Elettroforesi a fronte mobile e zonale, supporti solidi, elettroforesi di proteine (in condizioni native e SDS-PAGE con applicazioni), rivelazione delle bande di proteine, Western blotting, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi di DNA, rivelazione delle bande di DNA, cenni di analisi di restrizione e delle sue applicazioni, Northern blotting, Southern blotting, sequenziamento del DNA.<br />
6. Elettroforesi bidimensionale e spettrometria di massa.<br />
7. Tecniche spettroscopiche:<br />
* Spettroscopia d’assorbimento: legge di Lambert-Beer, schema di un colorimetro e di uno spettrofotometro. Spettri di assorbimento di proteine. Saggi colorimetrici per determinare la concentrazione di proteine.<br />
* Spettroscopia d’emissione di fluorescenza: principi (emissione da stato di singoletto e da stato di tripletto, shift di Stokes, resa quantica di fluorescenza), applicazioni (studio delle dinamiche proteiche, quenching collisionale e esposizione di fluorofori al solvente, FRET e sensori per il calcio).<br />
* Dicroismo circolare: principi (radiazione linearmente polarizzata, radiazione circolarmente polarizzata, radiazione elitticamente polarizzata ed elitticità). Applicazioni allo studio della struttura delle proteine.<br />
* NMR: cenni di applicazioni allo studio della dinamica e della struttura di proteine. Arricchimento isotopico delle proteine per espressione in terreni minimi.<br />
8. Tecniche enzimatiche:<br />
* Studi allo stato stazionario: metodi continui e metodi discontinui. Saggi diretti, indiretti e accoppiati. Substrati cromogenici. Metodi radioisotopici e separazione dei prodotti.<br />
* Studi allo stato pre-stazionario: metodi di mescolamento rapido (stopped-flow) e metodi di rilassamento (pH-jump con composti caged-H+).<br />
9. Tecniche immunochimiche: gli anticorpi (struttura, specificità, marcatura). Produzione di anticorpi monoclonali e policlonali. Immunodosaggi: RIA ed ELISA. Applicazioni: test di gravidanza e test per l’HIV.<br />
10. Gli isotopi radioattivi: utilizzo e misura della radioattività.<br />
11. Cristallizzazione di proteine: principi e metodi. Diffrazione dei raggi X, mappe di diffrazione, mappe di densità elettronica. Protein data bank: cenni sull’utilizzo e visualizzazione di strutture tridimensionali di proteine.

Programma esteso

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Bibliografia

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Wilson e Walker: “Biochimica e Biologia Molecolare", Nuova edizione italiana. Cortina Editore.<br />
Reed et al.: “Metodologie di base per le scienze biomolecolari”. Zanichelli<br />
T.A. Brown. “Biotecnologie Molecolari: Principi e Tecniche”. Zanichelli<br />
NELSON e COX: “I principi di biochimica di Lehninger”, 4 ed. Cap.9. Zanichelli

Metodi didattici

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Modalità verifica apprendimento

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Altre informazioni

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