TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
cod. 07373

Anno accademico 2008/09
3° anno di corso - Primo semestre
Docente
Settore scientifico disciplinare
Biologia molecolare (BIO/11)
Field
Discipline biochimiche, biomolecolari e genetiche
Tipologia attività formativa
Caratterizzante
24 ore
di attività frontali
3 crediti
sede:
insegnamento
in - - -

Obiettivi formativi

Il corso si propone di introdurre le tecniche di base di biologia molecolare utilizzate nell'isolamento e clonaggio di geni.<br /><br />

Prerequisiti

Si richiede il superamento dell’esame di Biochimica e Biologia Molecolare

Contenuti dell'insegnamento

<br /><br />1. Enzimi· Enzimi di Restrizione· Metilazione del DNA·Ligasi· DNA polimerasi· Trascrittasi Inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)·Terminal Transferase· RNA polimerasi· Polinucleotide kinasi del fago T4·Fosfatasi alcaline· Nucleasi<br />2. Purificazione del DNA e dell’RNA· Lavaggi con Fenolo, Fenolo-Cloroformio,Cloroformio· Precipitazione con Alcol ed essicamento · Risospensione in TE oacqua· Determinazione della concentrazione e della purezza<br />3. Batteri· Terreni di crescita· Genotipo· Conservazione e propagazione<br />4. Plasmidi batterici· Replicazione e Incompatibilità· Mobilità· Marcatori diSelezione· Sviluppo dei plasmidi come vettori di clonaggio· Estrazione epurificazione del DNA plasmidico dai batteri· Digestione con enzimi direstrizione· Purificazione dei prodotti di digestione · Ligazione· Strategie diligazione di un DNA esogeno in un vettore plasmidico· Trasformazione deibatteri· Identificazione delle colonie batteriche contenenti plasmidiricombinanti· Identificazione del ricombinante di interesse· Possibilirisultati di una ligazione + trasformazione· Controlli sulla ligazione +trasformazione · Amplificazione e conservazione dei cloni e librerieplasmidiche<br />5. Batteriofagi lambda· Biologia molecolare del batteriofago lambda·Costruzione dei vettori basati sul batteriofago lambda· Titolazione deibatteri· Titolazione dei fagi· Estrazione e purificazione del DNA fagico·Preparazione di fagi ricombinanti· Identificazione delle placche che contengonofagi ricombinanti· Amplificazione e conservazione dei cloni o delle libreriefagiche<br />6. Cosmidi· Caratteristiche dei cosmidi· Costruzione di librerie genomiche incosmidi· Amplificazione e conservazione dei cloni o delle librerie cosmidiche<br />7. Batteriofagi filamentosi a singolo filamento· Biologia molecolare deibatteriofagi filamentosi· Clonazione nella regione intergenica della RF·Trasformazione e formazione delle placche· Identificazione delle placche checontengono fagi ricombinanti· Estrazione e purificazione del DNA fagico·Moltiplicazione dei fagi in terreno liquido · Purificazione del DNA fagico (PEG+ Fenolo-cloroformio)· Amplificazione e conservazione dei cloni<br />8. Fagemidi · Caratteristiche dei Fagemidi· Clonaggio nei Fagemidi· Produzionedel DNA a filamento singolo mediante Fago Helper· Costruzione di librerie acDNA in fagemidi· lambdaZAP: caratteristiche· Clonaggio e recupero del plasmide<br />9. Elettroforesi su gel · Elettroforesi su gel di agarosio· Recupero del DNAdal gel· Gel di agarosio denaturante (alcalini, formaldeide)· Elettroforesi sugel di poliacrilamide non denaturante· Elettroforesi su gel di poliacrilamidedenaturante· Autoradiografia· Recupero del DNA dal gel. Analisi e clonaggio diDNA genomico eucariotico· Isolamento di DNA genomico eucariotico·Frammentazione del DNA genomico· Dimensione di una libreria genomica· Vettoriad alta capacità usati per librerie genomiche· Screening di una libreriagenomica<br />10. Estrazione e purificazione dell’RNA· Preparazione dei materiali e dellesoluzioni utilizzati nelle estrazioni di RNA· Metodi classici di estrazione·Separazione del Poli(A)+RNA<br />11. Costruzione e analisi di librerie a cDNA· Dimensioni di una libreria dicDNA· Sintesi del primo filamento del cDNA· Sintesi del secondo filamento delcDNA· Clonaggio del cDNA in un vettore· Screening mediante ibridazione di acidinucleici<br />12. PCR· Componenti essenziali della PCR· Fasi termiche della PCR·Progettazione dei primer· Problema delle contaminazioni· Hot start · Analisiper elettroforesi su gel· Clonaggio degli ampliconi· Nested PCR· Long PCR·Mutagenesi per PCR· Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)· Touchdown PCR<br />13. Sequenziamento· Metodo di Maxam e Gilbert· Metodo di Sanger· Sequenziamentodi frammenti di DNA lunghi e di interi genomi 

Programma esteso

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Bibliografia

Dai geni ai genomi - Dale, von Schantz - EdiSES<br />Analisi dei geni e genomi - Richard J.Reece - EdiSES<br />Ingegneria genetica. Principi e tecniche. S.Primrose et al. - Zanichelli<br />DNA Ricombinante - J.D.Watson et al. - Zanichelli

Metodi didattici

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Modalità verifica apprendimento

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Altre informazioni

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