Descrizione e scopo
L’ossido nitrico (NO) svolge numerose funzioni biologiche, per comprendere le quali è importante seguirne la dinamica a livello di singola cellula. Finora sono stati sviluppati e proposti solo pochi sensori fluorescenti geneticamente codificati (GES) per il monitoraggio dei livelli intracellulari di NO. Grazie alle competenze multidisciplinari del team, il progetto propone lo sviluppo di sistemi molecolari per seguire la concentrazione di NO in tempo reale a livello di singola cellula.
Sito Web: https://smfi.unipr.it/molecular-platform-intracellular-nitric-oxide-sensing
Finalità
Questo progetto si propone di utilizzare proteine fluorescenti (FP) come semplici sensori di NO per ottenere una piattaforma molecolare di GES adatta a tecniche di imaging di fluorescenza. Verranno studiati i meccanismi che stanno alla base della sensibilità all’NO dell’emissione di fluorescenza di FP con Cys esposte al solvente in modo da ottimizzarne le prestazioni. Verranno anche sviluppate proteine chimeriche per rivelazione raziometrica e dalla sensibilità estesa al nM.
Risultati attesi
Intendiamo comprendere i meccanismi fisici alla base della sensibilità all’NO mostrata da diverse FP. Ci attendiamo di ottenere proteine funzionali sia per studi preliminari in vitro sia per studi all’interno di sistemi cellulari. Oltre alle FP a singolo dominio, ci attendiamo di poter estendere i costrutti realizzando sistemi di rivelazione raziometrici. Ci attendiamo infine una estensione della sensibilità verso basse concentrazioni di NO implementando un sensore basato su una nitroforina.
Risultati raggiunti
Utilizzando in modo integrato la modellistica molecolare, la mutagenesi, la spettroscopia e la microscopia a fluorescenza, abbiamo compreso a fondo le interazioni tra i residui di Cys nitrosilati e il cromoforo della FP. È stato sviluppato un GES raziometrico con una proteina di fusione tra una FP sensibile all'NO ed una insensibile. È stato anche realizzato un GES fondendo una FP che emette nel blu e una nitroforina legante l'NO per ottenere una coppia FRET.
