Descrizione e scopo
Nel corso degli ultimi anni, gli indicatori fluorescenti codificati geneticamente (GEFI) basati su proteine fluorescenti sono stati ampiamente utilizzati come sonde di network biologici in cellule vive attraverso microscopia di fluorescenza funzionale. Quasi tutti i sistemi sviluppati consentono applicazioni in microscopia convenzionale, la cui risoluzione spaziale è limitata dalla diffrazione. Il progetto GEFInder si propone di sviluppare GEFI compatibili con la microscopia a super-risoluzione.
Finalità
L'obiettivo generale del progetto GEFInder è lo sviluppo di nuovi GEFI basati su proteine fluorescenti, in grado di fornire mappe nanometriche realmente funzionali delle attività delle cellule viventi attraverso la microscopia a superrisoluzione. Mediante design razionale si intendono sviluppare GEFI compatibili con tecniche STED (STimulated Emission Depletion) e SOFI (Super-resolution optical fluctuation imaging), per garantire letture raziometriche calibrabili in contesti cellulari reali.
Risultati attesi
Le capacità di photoswitching dei GEFI saranno studiate mediante spettroscopia di assorbimento transiente al nanosecondo. La resa quantica sarà valutata mediante analisi quantitativa della cinetica di conversione mediante metodi comparativi utilizzando FP fotocromiche di riferimento. Informazioni sulla cinetica di photoswitching in condizioni di illuminazione al microscopio saranno ottenute dalla spettroscopia di correlazione di fluorescenza con eccitazione a due colori.
Risultati raggiunti
Applicando la mutazione E222Q a un derivato della GFP abbiamo creato una reversibly switching fluorescent protein compatibile con applicazioni di microscopia a super risoluzione in modalità SOFI. Mediante misure di confronto con lo standard RSEGFP sono stati determinate cinetiche ed efficienze di fotoconversione utilizzando assorbimento transiente al nanosecondo e spettroscopia di correlazione della fluorescenza.
